Desarrollo y evaluación de una técnica ELISA con antígeno crudo de Trypanosoma cruzi para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas

Fundamentos: La creciente inmigración procedente de América Central y del Sur ha convertido el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en un proceso habitual en los laboratorios españoles. El trabajo describe el desarrollo y evaluación de una técnica ELISA para el diagnóstico serológico de dicha enfermedad. Métodos: El antígeno se obtuvo por sonicación de epimastigotes de Trypanosoma cruzi y se fijó a la placa de microtitulación a una concentración proteica de 20 g/ml. El conjugado enzimático fue la Proteína A-peroxidasa y el substrato cromogénico el OPD. Se cuantificaron los resultados en forma de unidades (U) que relacionan la densidad óptica obtenida en los sueros problema con la de un suero calibrador establecido en 100 U. Resultados: El umbral de positividad calculado sobre 325 sueros negativos fue de 20 U. La sensibilidad, determinada sobre 114 sueros de muestras con PCR positiva para T. cruzi, fue de 98,2% (intervalo de confianza 95%, 93,2-99,7%). La especificidad, determinada sobre 179 sueros de donantes de zona endémica, negativos en dos técnicas serológicas distintas, fue de 100% (IC 95%, 97,4-99,9). El coeficiente de variación interplaca, calculado en 50 placas consecutivas, fue 0,09. La comparación de los resultados con los obtenidos mediante una técnica ELISA con antígenos recombinantes, en 764 muestras de suero, aportó una correlación r de 0,85 (p=0,01) y una medida de acuerdo (kappa de Cohen) de 0,81. Conclusión: La técnica desarrollada reúne los requisitos necesarios para ser aplicada en el diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas.

Introduction: The diagnosis of Chagas disease is now a routine procedure in Spanish laboratories due to the increasing immigration from Latin-American countries. The paper describes the development and evaluation of an ELISA technique for the serologic diagnosis of Chagas disease. Methods: Antigen was obtained by sonication of Trypanosoma cruzi epimastigotes and was used at a protein concentration of 20 g/ml. The enzymatic conjugate was Protein A- peroxi-dase and the chromogenic substrate was OPD. Results were quantified as units (U) that relate the optical density obtained in the problem sera with that of a calibrator serum, arbitrarily set at 100 U. Results. The cut-off was calculated on 325 negative sera and established at 20 U. The sensitivity was determined on 114 sera from blood samples with a positive PCR for T. cruzi and calculated to be 98.2 % (95% confidence interval, 93.2-99.7%). The specificity was determined on 179 sera from blood donors from endemic areas that were found to be negative by two serological techniques, and calculated to be 100% (95% CI, 97.4-99.9). The coefficient of variation between plates, calculated on 50 consecutive plates, was 0.09. The comparison of results with those obtained with another ELISA technique using recombinant antigens, on 764 sera, gave a correlation coefficient r of 0.85 (p=0.01) and an agreement coefficient (Cohen?s kappa) of 0.81.